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显微技术
分析仪器采购网(www.myiqi.cn)  2016-6-7  
【导读】显微技术(microscopy)是利用光学系统或电子光学系统设备,观察肉眼所不能分辨的微小物体形态结构及其特性的技术。
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  显微技术(microscopy)是利用光学系统或电子光学系统设备,观察肉眼所不能分辨的微小物体形态结构及其特性的技术。

  包括:①各种显微镜的基本原理、操作和应用的技术;②显微镜样品的制备技术;③观察结果的记录、分析和处理的技术。

  光学显微镜的发展史

  原始的光学显微镜是一个高倍率的放大镜。据记载,在1610年前意大利物理学家伽利略已制作过复式显微镜观察昆虫的复眼。这是一种已具目镜、物镜和镜筒等装置,并固定在支架上的显微镜。荷兰人 A·van·列文虎克一生制作了不少于247架显微镜,观察了许多细菌、原生动物和动、植物组织,是第一个用显微镜作科学观察的人。到18世纪显微镜已有许多改进,应用比较普遍,已作为一种商品进行生产。

  1872~1873年,德国物理学家和数学家E·阿贝提出了光学显微镜的完善理论,从此,镜头的制作可按预先的科学计算进行。同时,德国化学家O·肖特成功地研制出供制作透镜的优质光学玻璃。他们和德国显微镜制作家卡尔·蔡司合作,建立了蔡司光学仪器厂,于1886年生产出具复消色差油镜的现代光学显微镜,达到了光学显微镜的分辨限度。从19世纪后期至20世纪60年代发展了许多类型的光学显微镜,如:偏光显微镜、暗视场显微镜、相差显微镜、干涉差显微镜、荧光显微镜。此外,还有许多特殊装置的显微镜,例如在细胞培养中特别有用的倒置显微镜。20世纪80年代后期又发展了一种同焦扫描激光显微镜,结合图象处理,可以直接观察活细胞的立体图,是光学显微镜的一大进展。

  电子显微镜的产生

  根据光的波粒二象性可以知道随着人类认知的发展光学显微镜观察微小物体的范围已经远远不能满足人们的需求,人们继续一个分辨率更高的显微镜,伴随这对电子、物质波的不断了解诞生了第一架电子显微镜。

  934年由M·诺尔和E·鲁斯卡在柏林制造成功第一台实用的透射电子显微镜。其成象原理和光学显微镜相似,不同的是它用电子束作为照射源,用电子透镜代替玻璃透镜,整个系统在高真空中工作。由于电子波长很短,所以分辨率大大提高。在电镜制作的实验阶段就曾尝试观察生物材料。1934年布鲁塞尔大学的L·马顿在美国就发表过用锇酸固定的茅膏菜植物叶子切面的电镜图。1949年A·克劳德、K·R·波特和E·皮克尔斯获得了第一张细胞超显微结构的电镜图。到20世纪50年代,透射电子显微镜在生物学的研究中已被广泛的应用。分辨率已由最初的500埃提高到小于2埃。

  电子显微镜的发展

  20世纪50年代扫描电子显微镜在英国首先制造成功。它是利用物体反射的电子束成象的,相当于光学显微镜的反射象。扫描电子显微镜景深大,放大倍率连续可变,特别适用于研究微小物体的立体形态和表面的微观结构。20世纪70年代以来,扫描电镜发展很快,在固体样品上可反射多种电子,结合信号分析装置,已成为研究物质表面结构的有力工具。扫描电镜的分辨率已由最初的500埃提高至50~30埃。电子显微镜的另一个发展是研制超高压电镜以增加分辨率和对原样品的穿透力。制成了3兆伏的加速电压的超高压电镜,可用来研究整体细胞和物质的分子结构象或原子结构象。

  显微样品制备技术

  1665年英国显微镜学家R·胡克把软木切成薄片才在显微镜下观察到细胞。列文虎克在1714年用藏红花作肌纤维切片的染色,这一简单的切片和染色可以说是制片技术的萌芽。从18世纪20年代开始,德国一些研究工作者在染料的发展上作出了很大的贡献;而英国一些显微镜学家则热心于制片技术的研究。经过100多年的实践,至19世纪中期显微制片技术才逐渐完善。1863年W·瓦尔代尔报告了用苏木精染色可以很好地显示染色体。1869年E·克莱布斯最先采用石蜡作为切片支持物来包埋材料。两年后,波姆和斯特里克勒把它发展为石蜡切片法。虽然早在1770年英国人卡明斯设计制作了切片机,但完善的转动式切片机直到1883年才由法伊弗在美国制造成功。这些重要的制片手段仍在使用。

  透射电镜样品制作的原理和操作与显微制片相似。1952年G·E·帕拉德采用缓冲的四氧化锇为固定剂获得良好的电镜图象,这一方法一直在延用。1949年纽曼采用二甲烯丙酸酯作为电镜样品切片的介质,获得了初步成功,后来改用了更合适的塑料,如环氧树脂Epon812。1953年K·R·波特和布卢姆首先采用了切超薄切片的超薄切片机,1950年拉塔和哈特曼偶然发现玻璃刀适合于超薄切片,从此玻璃刀成了电镜切片的主要用刀,并且还在使用。当然费尔南德斯-莫兰发明的砧石刀效果更好,并且是制作连续切片所必不可少的。1950年吉本斯和布雷德菲尔德证明电子图象的细节可由重金属染色而增强,从而发展了广泛使用的电子染料。

  扫描电镜的样品制备比较简单。干燥的样品仅需金属涂膜使样品表面导电即可观察。生物材料一般需要固定、脱水、干燥和涂膜等步骤。此外,还可对所观察的对象进行各种手术,这种在显微镜下操作的技术称为显微操作。

  关于观察的结果

  结果处理的重要性
  显微镜及电子显微镜下所见显微图象及其显示的信息是被观察物体和辐射波之间相互作用的效应,有些信息是可以直接用肉眼看到和识别的,有些则不能直接看到和识别。因此对显微技术所获得的信息的接收、分析和处理就十分重要。

  生物图像处理技术
  光学显微镜所观察到的图象可为肉眼所接受和识别。这种直接观察的结果用描图仪依象勾画,即可记录;用显微摄影、显微电影或录像,则可更正确地记录。但在电子显微镜发展至高分辨率后,对极精细的结构,如对物质的分子或原子结构图的接收和解释,就会遇到许多困难,因为图象和样品的真实情况之间,在接收和显示中可能发生各种误差,不加校正和分析就无法获得理想的图象或作出正确的解释。这种对电子图象进行处理和分析的技术已发展成为一个专门的学科:生物图像处理技术。显微技术愈是深入的发展,图象处理技术愈益重要。

  应用

  18~19世纪显微技术的发展推动了生物学,特别是细胞学的迅速发展。例如,19世纪后叶细胞学家对受精作用、染色体的结构和行为的研究,就是在不断改进显微技术的过程中取得很大成就的,而这些成就又为细胞遗传学的建立和发展打下了基础。此外,显微技术在细胞学、组织学、胚胎学、植物解剖学、微生物学、古生物学及孢粉学发展中,已成为一个主要研究手段。

  电子显微镜的发明促使生物学中微观现象的研究从显微水平发展到超显微水平。超微结构的研究结合生物化学的研究,使以形态描述为主的细胞学发展成为以研究细胞的生命活动基本规律为目的细胞生物学。

  20世纪70年代以来,由于电子显微镜分辨率的不断提高并与电子计算机的结合应用,许多分子生物学的现象,例如DNA的转录、DNA分子杂交等在生物化学中用同位素技术可证实的现象,也可在电子图象中获得直观的证实,许多生物大分子的结构和功能也可从电子图象的分析中加以认识。总之,利用显微技术进行的生物学研究可以反映细胞水平、超微结构水平,甚至分子水平三个不同的层次的信息。三者各具特点,同时又是相互联系和相互补充的。

  在医疗诊断中,显微技术已被用为常规的检查方法,如对血液、寄生虫卵、病原菌等的镜检等。利用显微技术作病理的研究已发展为一门专门的学科——细胞病理学,它在癌症的诊断中特别重要。某些遗传病的诊断,已离不开用显微技术作染色体变异的检查。此外,在卫生防疫、环境保护、病虫害防治、检疫、中草药鉴定、石油探矿和地层鉴定、木材鉴定、纤维品质检定、法医学、考古学、矿物学以及其它工业材料和工业产品的质量检查等方面,都有广泛的应用。

  展望

  从20世纪70年代以来的发展趋势看,显微技术的进展将体现在以下几个方面:

  ①技术上将更快地向定量显微术方向发展;

  ②在仪器上不论是光学显微镜还是电子显微镜,都将从单一功能的仪器向多功能组合的大型仪器发展;

  ③在操作上将在更大程度上引入电子学技术,从而向更高的自动化操作发展;

  ④图象分析技术将迅速地在显微技术中广泛的应用;

  ⑤设法解决在超微结构水平上作活体的观察。曾经尝试创制高分辨率的X射线显微镜来观察活体,但还没有获得理想的结果。
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